Activation Tagging: Perangsang Ekspresi Gen Secara Acak pada Padi

Era pengungkapan sekuen genom padi telah berlalu. Tantangan yang ada sekarang adalah bagaimana mengidentifikasi fungsi biologi dari beribu-ribu gen tersebut. Berbagai pendekatan telah dilakukan untuk menemukan fungsi gen. Pendekatan yang paling sering dilakukan adalah dengan cara merusak atau mengganggu suatu gen dan selanjutnya melihat efek yang ditimbulkan dari kerusakan tersebut. Beberapa metode telah dikembangkan untuk tujuan ini seperti menggunakan mutagen (penyebab mutasi) ethyl methanesulfonate (EMS) dan/ atau insersi transfer-DNA (T-DNA). Insersi T-DNA, terutama pada padi, telah dijelaskan pada edisi yang lalu. Pada insersi T-DNA, suatu gen dikondisikan dalam keadaan “KO” sehingga tidak terekspresi, kemudian efeknya bisa dilihat pada penampakan fenotip.

Selain teknik T-DNA tagging, ada teknik lain yang merupakan perkembangan dari T-DNA tagging itu sendiri yaitu activation tagging. Activation tagging bisa dikatakan sebagai metode yang sedikit bersebrangan dengan T-DNA tagging. Karena melalui pendekatan ini, suatu gen dikondisikan dalam keadaan over atau redundant (berlebih). Dari teknik ini, bisa dilihat efek apa yang akan timbul setelah suatu gen mengalami ekspresi yang berlebihan. Meskipun sistem activation tagging telah secara luas digunakan pada Arabidopsis, kegunaannya pada tanaman padi masih belum banyak muncul. Maka kemungkinan penggunaan activation tagging pada padi perlu diaplikasikan. Hal inilah yang memberikan inspirasi An Gynheung, ilmuwan Korea, untuk membuat suatu konstruksi vektor untuk menghasilkan galur activation tagging pada padi.

Perbedaan activation tagging dengan over-ekspresi

Teknik over-ekspresi telah dikenal sejak lama dalam ilmu bioteknologi. Tujuan dari teknik ini adalah membuat ekspresi gen yang telah diketahui fungsinya agar terekspresi secara berlebihan. Atau bisa juga digunakan untuk mengekspresikan gen yang berasal dari jenis tanaman yang berbeda bahkan dari mikroba sekalipun. Aplikasi teknik ini sering digunakan pada tanaman pangan komersial atau tanaman untuk bahan dasar dari suatu produk tertentu. Contohnya pada padi, teknik ini digunakan untuk meningkatkan kadar protein biji dengan cara introduksi gen yang bertanggung jawab terhadap biosintesa protein. Sedangkan pada tebu, seringkali digunakan untuk meningkatkan rendemen dengan cara over-ekspresi gen yang bertanggung jawab terhadap biosintesa sukrosa. Teknik ini memang relatif mudah, tetapi memiliki beberapa kelemahan yaitu kita terlebih dahulu harus benar-benar mengetahui fungsi suatu gen. Selain itu, sekali transformasi ke tanaman, hanya akan didapatkan satu gen yang mengalami over-ekspresi.

Activation tagging menggunakan T-DNA yang mengandung multimerized promoter dari cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S [1,2]. Istilah enhancer (perangsang transkripsi) sering digunakan untuk multimerik promoter. Tidak harus dekat dengan lokasi gen yang terinsersi, meskipun terletak agak jauh dari lokasi suatu gen, enhancer mampu mengaktifkan transkripsi sehingga terjadi mutasi dominan (gain of function mutation). Aktivasi suatu gen bisa menimbulkan fenotip (penampakan) baru yang bisa digunakan untuk mengindentifikasi fungsi suatu gen terutama yang memiliki banyak famili atau penting untuk kelangsungan hidup. Kelebihan penggunaan activation tagging adalah sifat T-DNA yang bisa menyebabkan mutasi random [3]. Secara sederhana, teknik activation tagging bisa dikatakan mirip dengan over-ekspresi, namun bedanya terletak pada sifatnya yang random sesuai lokasi inseri T-DNA. Kelebihan lainnya adalah sekali insersi, dapat menghasilkan beribu-ribu galur padi activation tagging.

Produksi padi transgenik dengan elemen enhancer

Sebuah laboratorium di Korea yang dipimpin oleh An Gynheung telah mengembangkan sebuah vektor (plasmid) dengan nama pGA2715 untuk menghasilkan padi transgenik dengan activation tagging [4]. Multimerized enhancer (E) dari promoter CaMV 35S terletak bersebelahan dengan tepi kiri (LB, left border). Sedangkan gen penanda seleksi tahan hygromycin (hph, hygromycin phosphotransferase) yang menggunakan promoter alpha tubulin terletak diantara gen gus dan enhancer (Gambar 1).

Dengan konstruksi vektor seperti itu, maka bisa didapatkan dua keuntungan yaitu bisa digunakan untuk activation tagging dan juga gene trapping. Untuk regenerasi padi transgenik dengan activation tagging, maka transformasi dengan menggunakan Agrobacterium mutlak diperlukan [5]. Agrobacterium memang sudah biasa dijadikan alat transformasi gen pada tanaman. Dari transformasi tersebut, saat ini sudah lebih dari 13.450 padi transgenik fertil (bisa menghasilkan biji) hasil transformasi pGA2715.

Meningkatnya ekspresi gen pada galur activation tagging

Untuk mengetahui aksi multimeraized CaMV 35S enhancer pada tingkat molekuler, kita harus melihat ekspresi dari gen yang telah terinsersi oleh elemen enhancer tersebut. Namun sebelumnya, perlu dilakukan genotyping PCR untuk memastikan bahwa suatu gen telah terinsersi. Setelah diketahui suatu gen telah tersinsersi, baru bisa dilakukan uji ekspresi gen dengan metode reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Bahan yang harus disediakan pertama kali untuk melakukan RT-PCR adalah RNA (ribonucleic acid). RNA bisa diekstraksi dari daun atau organ lain pada tanaman. Ekstraksi RNA bertujuan untuk memisahkan RNA dari bahan-bahan lain seperti DNA (deoxyribonucleic acid) dan protein. Apabila RNA sudah tersedia, maka tahap lanjutannya adalah RT-PCR. Dalam hal ini RNA digunakan sebagai cetakan reaksi (template). Bahan-bahan lain yang harus disediakan selain RNA adalah sepasang primer, buffer, enzim reverse transcriptase, dNTPmix (campuran deoxy-nukleotide triphosphat), dan enzim polymerase. Yang perlu diingat adalah bahwa primer bersifat sangat spesifik untuk setiap gen. Maka dalam membuat (memesan) primer, sebaiknya harus dilihat apakah ada gen lain yang memiliki kesamaan (homology) tinggi dengan gen yang akan kita lihat ekspresinya. Karena jika itu terjadi maka bisa menyebabkan munculnya ekspresi gen yang semu.

Tahap berikutnya adalah membandingkan ekspresi gen pada tanaman homozygous, heterozygous dan normal (wild type). Dalam penulisannya, simbol yang biasa digunakan untuk tanaman normal adalah W/W, sedangkan untuk tanaman heterozygous dan homozygous berturut-turut adalah T/W dan T/T. Sebagai kontrol tingkat transkripsi, gen actin1 seringkali menjadi pilihan karena transkripnya yang relatif stabil dalam segala kondisi. Sebagai contoh dapat dengan jelas dilihat pada gambar berikut:

Gambar di atas menunjukkan bagaimana sebuah enhancer berfungsi dalam meningkatkan ekspresi suatu gen. Pada gambar A dan B, lokasi enhancer terletak pada daerah 5’UTR (untranslated region) dari gen hypothetical protein (belum diketahui fungsinya) dan xylose isomerase (enzim yang mengubah xilosa menjadi fruktosa). Sedangkan pada gambar C dan D, enhancer berada di daerah 3’UTR dari gen OsBRI1 (reseptor brassinosteroid) dan Cf2/Cf5 (gen tahan penyakit). Lokasi enhancer yang terletak pada 5’UTR atau pun 3’UTR tidak mempengaruhi kemampuan dalam meningkatkan ekspresi gen. Hal ini dapat dilihat dari tingkat ekspresi pada tanaman homozygous (T/T) dan heterozygous (T/W) yang jauh lebih tinggi dibanding tanaman normal (W/W).

Penyediaan database activation tagging padi

Meskipun secara umum elemen enhancer 35S mampu meningkatkan ekspresi gen yang berada di dekatnya, sampai saat ini hanya sejumlah kecil mutan activation tagging yang telah berhasil diisolasi. Berdasarkan laporan oleh Weigel (2000) dan Marsch-Martinez (2001), freukeunsi mutasi dominan yang disebabkan oleh activation tagging berturut-turut adalah 0.1% dan 1% [6,7]. Rata-rata yang rendah ini diduga karena meningkatnya ekspresi gen oleh enhancer kemungkinan tidak selalu diiringi oleh penampakan fenotip.

Namun demikian, penyediaan database activation tagging pada padi masih harus dikembangkan untuk kemudahan akses informasi dan pengungkapan fungsi suatu gen. Salah satu hal yang bisa dilakukan adalah mendapatkan flanking sequence dari activation tagging dengan metode inverse PCR. Di masa yang akan datang, penyediaan data base ini bisa menjadi pengganti terbatasnya pengungkapan fungsi gen melalui pendekatan forward genetic.

Bahan bacaan:

1. Hayashi, H. et al. Activation of a plant gene by T-DNA tagging: auxin-independent growth in vitro. Science 1992; 258: 1350-1353.

2. Suzuki, Y. et al. A novel transposon tagging element for obtaining gain-of-function mutants based on a self-stabilizing Ac derivative. Plant Mol Biol 2001; 45:123-131.

3. Azpiroz-Leehan, R. and Feldmann, K.A. T-DNA insertion in Arabidopsis: going back and forth. Tren. in Gen 1997; 13(4): 152-156.

4. Jeong, D.H. et al. T-DNA insertional mutagenesis for activation tagging in rice. Plant Physiol 2002; 130: 1636-1644.

5. Lee, S. et al. Binary vectors for efficient transformation in rice. J.Plant Bio 1999; 42(4): 310-316.

6. Weigel, D. et al. Activation tagging in Arabidopsis. Plant Physiol 2000; 122: 1003-1013.

7. Marsch-Martinez N., et al. Activation tagging using the En-I maize transposon system in Arabidopsis. Plant Physiol 2002; 129: 1544-1556.

M. Suudi, program Doktor pada Laboratorium Plant Molecular Physiology, Department of Molecular Biology, Gyeongsang National University, Republic of Korea.

0 Responses to “Activation Tagging: Perangsang Ekspresi Gen Secara Acak pada Padi”



  1. Leave a Comment

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s




IP

Jakarta

April 2008
M T W T F S S
« Mar   May »
 123456
78910111213
14151617181920
21222324252627
282930  

Klik tertinggi

  • None

Blog Stats

  • 451,470 hits

%d bloggers like this: